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原核表达-IPTG诱导表达原理及实验步骤

来源:化工产品网-原创 发布时间:2024-01-05 20:24:35
原核表达-IPTG诱导表达原理及实验步骤

原核表达是一种常用的基因工程技术,可以在大肠杆菌等原核细胞中表达外源基因。IPTG是一种常用的诱导剂,可以促进目标基因的表达。本文将介绍IPTG诱导表达原理及实验步骤。

一、IPTG诱导表达原理

在原核细胞中,外源基因通常被克隆到表达载体中。表达载体中包含启动子、转录因子结合位点、翻译起始位点等元件,这些元件共同作用使得外源基因得以表达。IPTG是一种人工合成的化合物,可以作为胆红素酶(lacZ)基因的诱导剂。胆红素酶是一种代表性的标记蛋白,其编码基因lacZ经过IPTG诱导表达后,可以在菌落或液体培养基中形成蓝色物质,从而实现对表达的检测。

IPTG的作用机制是通过模拟大肠杆菌内源性诱导剂丙内酰辅酶A(AcCoA)的作用,促进lacZ基因的表达。在正常情况下,大肠杆菌细胞内的LacI蛋白可以结合到lacZ启动子上阻止其转录。当AcCoA浓度增加时,AcCoA可以与LacI结合,从而导致LacI脱离启动子,允许lacZ基因转录。而IPTG与LacI的结合能力更强,可以迅速将LacI从启动子中驱逐出来,从而促进lacZ基因的表达。

二、实验步骤

1. 构建表达载体:将目标基因克隆到表达载体中,构建重组质粒。

2. 转化大肠杆菌:将重组质粒导入大肠杆菌中,通过热激冲法或电转化法等方法实现转化。

3. 筛选阳性克隆:将转化后的大肠杆菌在含有抗生素的培养基上进行筛选,筛选出含有重组质粒的阳性克隆。

4. IPTG诱导表达:将阳性克隆分别接种到含有IPTG的培养基中,培养一定时间后,观察菌落或液体培养基中是否出现蓝色物质。

需要注意的是,在实验中要控制IPTG的浓度,过高的浓度会造成细胞毒性和表达不稳定等问题。此外,IPTG的加入时间和时间长度也需要进行优化,以达到最佳表达效果。

总之,IPTG诱导表达是一种常用的原核表达技术,通过模拟内源性诱导剂的作用,促进外源基因的表达,为基因工程研究提供了重要的工具。


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